郝牧教授：随着我们对骨髓瘤(MM)病理生理学的理解和认识的深入，改变了治疗范式及患者结局，深入的临床前研究促进了更有效的靶向治疗的发现。然而，肿瘤细胞持续存在的遗传复杂性和不稳定性，以及与促进肿瘤、免疫抑制的骨髓微环境的相互作用，仍然是MM治疗面临的重要障碍。全球MM病例从1990年到2016年增加了126%，突出表明迫切需要新的治疗方法。

郝牧教授：多发性骨髓瘤是一种以浆细胞恶性增殖为特征的血液肿瘤。在MM的发生、发展过程中，几乎所有患者都经历从一个相对良性的过程，即单克隆免疫球蛋白增多症（MGUS）到冒烟型骨髓瘤（SMM），进一步发展成为活动性骨髓瘤(active MM，即MM)的3部曲。在MGUS阶段，病人可出现血或尿M蛋白异常增多，但无骨病、贫血等临床症状；活动性骨髓瘤的诊断标准需达到骨髓中恶性浆细胞比例大于10%，有骨病、贫血、肾功能不全、高钙血症等临床症状（CRAB症状）；SMM介于MGUS和活动性MM之间。每年大约有1%的MGUS患者会进展为活动性MM，SMM则有10%患者会进展成为活动性MM。研究发现在MM发生过程中，在MGUS阶段就出现了基因组不稳定，染色体异位以及染色体数目的异常，包括亚二倍体、四倍体及超二倍体等，导致定位在这些染色体上的基因表达异常，比如调控细胞周期基因CCND1、CCND2、CCND3等异常高表达，使浆细胞增殖加速和肿瘤的发生。目前许多研究探讨了延迟SMM，尤其是高危SMM（HR-SMM）进展的治疗策略。最近的研究显示，对MGUS、HR-SMM、MM患者配对样本进行二代基因组测序(NGS)分析已被证明是发现决定MM疾病起始事件及发生时间的有用工具。

在MM发生过程中伴随着众多基因表达异常。2010年左右来自美国小石城的研究者通过基因芯片检测发现，根据基因表达差异可将初诊MM患者分为7个亚群，7个亚群患者生物学特征以及生存时间出现明显差异。而我国一直缺乏相关的研究，最近我们通过RNA测序技术对中国MM患者基因表达也进行了研究，不同患者之间的基因表达谱具有明显的异质性，根据基因表达差异可将我们病人分为6个不同亚群。进一步分析发现MM患者肿瘤细胞异质性明显，可被分为若干个亚群（亚克隆）；不同亚群的肿瘤细胞之间存在明显基因表达异质性，不同亚群MM细胞增殖活性也明显不同。在不同的患者中，肿瘤细胞亚群的主克隆是不一样的，并且这些肿瘤克隆的生物学特性还影响了环境中免疫细胞功能，导致免疫抑制微环境的形成，共同促进MM的发生和发展。2020年美国血液学年会（ASH）上，来自欧洲的研究团队报道了他们基于ISS分期系统结合MM细胞基因表达谱（SKY-92）可以对MM患者进行分层的研究结果。他们发现，联合SKY92和ISS分期系统可以将患者分为低危、中危、高危三个群体，可预测患者生存时间。我们的研究发现可以通过单细胞测序将RISSⅢ期的高危患者进一步区分为高危和超高危的患者。

此外，MM疾病发生发展过程中肿瘤细胞的遗传学也在发生着相应的改变，复发时肿瘤细胞的遗传学变得更加复杂多样。在MM疾病进展过程中由于药物选择压力或者肿瘤微环境的改变，那些对恶劣环境抵抗力更强的肿瘤细胞得以保存下来，继续增殖存活，这些肿瘤克隆对治疗不敏感，对DNA损伤修复能力更强，成为后期疾病复发的根源。最近我们课题组对药物治疗之后残留浆细胞(PCs)的生物学和遗传学特征进行了研究，反映了治疗压力下不同的克隆选择模式。治疗诱导克隆选择对生存率有显著影响(HR = 4.0， P<0.001)。残余PCs的细胞遗传学结构在一定程度上可以预测复发时的进化模式。由于药物的压力导致克隆发生了演变，这也为患者今后复发耐药埋下了祸根。因此目前对于临床治疗来复发患者的治疗成为我们面临的最大挑战。

郝牧教授：多发性骨髓瘤的发生发展与肿瘤细胞所处的微环境密切相关，高度依赖骨髓微环境是骨髓瘤发病的另一个突出特征。骨髓微环境在MGUS进展成活动性骨髓瘤中也发挥关键作用。MGUS大概每年有1%的患者可以进展成活动性骨髓瘤，然而有一部分MGUS患者一年内就可进展为活动性骨髓瘤，该结果提示，骨髓微环境异常参与，甚至决定MGUS向MM的疾病进展。我们的研究发现骨髓瘤细胞和微环境细胞及非细胞成分之间存在复杂的信号传递，参与肿瘤细胞的增殖存活，耐药性的产生，以及骨髓瘤骨病和贫血的发生和发展。这也是导致多发性骨髓瘤难治复发的根源。

染色体的不稳定参与了骨髓瘤骨病的发生和发展。我们的研究发现在MM细胞中，高表达多种染色体不稳定基因，且与骨髓瘤骨病严重程度呈正相关。提示染色体不稳定的基因除了可以影响骨髓瘤细胞本身的增殖耐药之外，还可能参与了骨髓瘤细胞对其环境中其它细胞功能异常的影响。我们体外和体内的实验证实染色体不稳定基因NEK2的高表达可促进单核巨噬细胞向破骨细胞的分化成熟，同时抑制成骨细胞的分化成熟，导致MM骨病的发生和发展。通过进一步的分子机制解析，我们发现NEK2可以通过与去泛素化酶USP7结合，稳定转录因子NK-κB，促进NK-κB下游分子HPSE的表达，进而促进破骨细胞活化导致骨病的发生。

我们总结了1300多例患者的信息发现，MM患者在初诊时有一半以上（55.2%）的患者存在中重度的贫血，而且随着疾病程度的加重，贫血逐渐加重，严重影响患者生存时间和生存质量。分离患者骨髓造血干祖细胞，体外分化诱导研究结果显示，与健康供者比较，来源于MM微环境的造血干祖细胞其红系分化功能明显受损，进一步小鼠体内实验证实了上述发现。机制上，通过RNA-seq、诱导分化等试验，我们发现骨髓内MM细胞的恶性增殖，导致大量产生细胞因子CCL3，CCL3通过与骨髓中造血干祖细胞表面受体CCR1或CCR5结合，抑制转录因子GATA-1、KLF-1表达，导致红系分化受抑和患者贫血的发生。同时，我们发现MM细胞大量产生的CCL3还可以作用于破骨细胞的前体细胞--单核巨噬细胞，促进单核巨噬细胞向破骨细胞的分化成熟，增加破骨细胞活性，这是导致骨髓瘤骨病发生的重要机制之一。数据库分析显示CCL3高表达患者的生存时间较低表达患者明显缩短。因此，骨髓微环境细胞与多发性骨髓瘤之间相互作用在MM细胞的恶性转变、恶性增殖、决定优势克隆以及骨髓瘤骨病及贫血的发生发展等病理生理过程中扮演了重要的角色。这也很好的解释了多发性骨髓瘤和微环境之间的相互依存。

2019年来自德国研究小组报道了MM的空间异质性，由于骨髓瘤存在散在分布的特征，不同部位的肿瘤微环境存在明显异质性，比如髓内骨髓瘤和髓外骨髓瘤的微环境和肿瘤生物学都存在显著差异。由于肿瘤细胞及微环境空间异质性的存在，导致同一个病人不同位置的细胞群，对于相同的治疗反应差别显著，单一位点骨髓穿刺并不能反应患者肿瘤细胞的总体特征，这也成为 MM 病情评价欠准确的重要原因。因此研发简单易行、低创伤性的早期诊断、疗效监测及预后评价的生物标志物对于 MM 临床诊疗有着重要的理论和现实意义。miRNA 是一类长度为 18-22nt 的内源性单链非编码 RNA，通过转录后调控基因表达。现已明确，miRNA 分子除参与正常细胞生长、发育、增殖、凋亡外，还在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。我们的研究发现，骨髓基质细胞可通过高分泌细胞因子IL-6，下调MM细胞miRNA-15a表达，进而导致miRNA-15a靶基因，如PHF19、Bcl-2等高表达，从而促进MM细胞的增殖加速以及耐药性的产生。PHF19在MM细胞内高表达抑制组蛋白H3K27me3水平从而导致下游MCL-1、BCL-xL、HIF-1α等基因高表达，导致骨髓瘤细胞的增殖活性加强，是多发性骨髓瘤发生发展和耐药的主要原因之一。我们的研究还证实上调miRNA-15a表达是MM潜在的治疗靶点。近年研究发现体液中存在 miRNA 分子，并且血浆 miRNA 具有肿瘤细胞特异性。由于血浆样本采集容易且可重复获得，有利于临床对疾病的追踪观察，并且 miRNA 具有稳定性好、不易降解的优点，因此循环 miRNA 是理想的非侵入性生物标志物，有着重要的应用价值和前景。我们的研究显示，循环miRNA-19a、miRNA-214、miRNA-135b是MM疾病理想的生物标志物。

因此，我们得出结论：骨髓瘤细胞遗传学的改变、肿瘤微环境与肿瘤细胞之间的相互作用共同导致了多发性骨髓瘤的发生和发展。干扰MM细胞与BM的相互作用是MM的理想治疗策略。

郝牧教授：骨髓瘤微环境中的细胞和非细胞成分支持着MM细胞的增殖、迁移、生存和耐药。近年来，随着免疫疗法在多发性骨髓瘤治疗中的异军突起，大家开始关注免疫微环境在多发性骨髓瘤发病以及在免疫治疗反应中的作用，希望寻找新的治疗靶点。研究发现多发性骨髓瘤存在免疫抑制的微环境，是促进MM发生发展的重要因素，其中涉及多种免疫细胞。我们研究发现MM微环境中T细胞功能和数量均存在异常。在MM微环境中T细胞数量较正常对照明显降低，对抗原刺激普遍不敏感。与正常对照比较，MM骨髓中T细胞对于抗原刺激处于一种无应答或者是减低应答的状态，从而导致T细胞活性被抑制。有文献报道MM骨髓中CD8+ T细胞的增殖活性普遍降低，给予抗原刺激之后，正常供者CD8+T细胞明显增殖活化，但是MM患者的CD8+T细胞几乎没有反应，不但没有扩增，甚至还有降低。同样，髓系来源的抑制细胞、调节性T细胞、Th17细胞、肿瘤相关巨噬细胞、基质细胞和破骨细胞也显著促进了肿瘤免疫逃逸和免疫抑制的临床状态。免疫逃逸还可通过增加免疫检查点(PD-1/PD-L1)在T细胞和MM细胞中的表达介导，与疾病从MGUS和SMM进展到MM相关。尽管临床前数据表明，阻断PD-1/PD-L1的获得了治疗效用，但早期临床试验却令人失望。

随着免疫靶向治疗的异军突起，MM在这方面药物也是层出不穷。比如我们熟悉单克隆抗体类药物，CD38单抗和CS1单抗等，以及针对BCMA靶点开发的免疫疗法，主要包括三大类：嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR-T），双特异性抗体（BiTES，靶向BCMA和CD3），抗体药物偶联物。这些新药物的出现给复发患者的治疗提供了新的选择。这类药物一方面可以直接杀伤肿瘤细胞，另一方面可以调节异常的免疫微环境。临床观察显示，CD38单抗确实是一个比较理想的抗MM靶向药物。CD38分子是在B细胞，浆细胞等分化过程中普遍存在的分子，因此CD38单抗具有直接杀伤肿瘤细胞的作用。进一步的研究发现CD38在T-reg、B-reg等免疫抑制细胞表面也有高水平表达，CD38单抗治疗还可以杀伤免疫抑制细胞，逆转免疫抑制微环境，共同清除肿瘤细胞。

细胞疗法是一种通过过继T细胞(ACT)或人工T细胞方法来恢复或增强肿瘤患者特异性免疫的额外策略。由于BCMA在浆细胞上相对特异性高表达，成为抗MM免疫治疗理想的靶标，也是多发性骨髓瘤肿瘤负荷的生物标志物。2019年新英格兰杂志报道了BCMA靶向嵌合抗原受体(CAR) T细胞治疗在MM治疗中的I期临床试验结果。数据表明BCMA CAR-T细胞治疗在复发难治的MM中（RRMM）取得理想的治疗效果，显示了深度和持久的反应。随着CAR-T细胞输注剂量的增多，患者治疗反应逐渐增强，生存时间也得到显著延长。然而随着BCMA CAR T治疗的临床试验的广泛开展，治疗后的复发经常被观察到，并且耐药的机制仍然不清楚。2021年Nature Communication杂志报道了，对一名初次CAR-T治疗后复发且对再治疗缺乏反应的患者的纵向样本进行了单细胞基因组特征分析结果。研究者发现在初始CAR-T细胞输注后，通过删除一个等位基因和在第二个等位基因上创建早期终止密码子的突变获得的BCMA双等位基因缺失克隆的选择。这种损失导致CAR-T细胞在第二次输注后缺乏增殖，这反映在患者血清中缺乏可溶性BCMA。该研究表明，在CAR-T治疗后复发的多发性骨髓瘤细胞中，需要仔细检测BCMA基因改变。同时期，Nature Medicine杂志，报告了一例不可逆的BCMA丢失的MM患者，该患者被纳入了KarMMa试验(NCT03361748)，并在抗BCMA CAR-T细胞治疗后出现进展，研究者发现选择TNFRSF17纯合子缺失的克隆(BCMA)是免疫逃逸的潜在机制。此外，研究者发现168例患者中37例存在杂合的TNFRSF17缺失或16号染色体单体，33例患者中28例非超二倍体MM患者中之前没有接受过BCMA靶向疗法，这表明治疗前存在TNFRSF17杂合性缺失，是导致免疫治疗后BCMA损失的危险因素，这也是CAR-T细胞治疗后复发的风险因素。BCMA CAR-T细胞治疗后，如果复发时BCMA表达缺失，将给下一步的治疗带来更为棘手的问题。BCMA表达虽然在初诊时与CAR-T细胞治疗无明显相关性，但是BCMA表达缺失却是CAR-T细胞治疗复发的风险因素。

郝牧教授：近年来，临床上虽然有很多新兴的治疗方案，但是这些治疗仍旧面临一些新的挑战。初治的MM，由于新药蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂的广泛使用以及自体造血干细胞及靶向药物（如CD38单抗）都使得初诊患者生存期有了明显的改善。但是临床治疗仍旧面临肿瘤复发，耐药的挑战。我们实验室关注并致力于研究MM复发耐药机制并进行肿瘤药物靶点的确认和药物研发。目前我们通过体内、体外实验发现吲哚类小分子化合物具有理想的抗骨髓瘤活性，由于与硼替佐米作用机制不同的，二者联合应用具有明显的协同作用，减低剂量和硼替佐米联合应用都可以很好的杀伤MM细胞。我们的研究结果已申报并获国家发明专利授权。

总体而言，我们实验室在邱录贵教授的带领下已经在MM方面建立了一个比较完善的涉及临床治疗、基础研究的转化医学体系，取得了一定的成果。将来，我们将对MM以及相关的浆细胞肿瘤发病机制深入研究，继续讲好我们自己的骨髓瘤故事。也希望能研发出中国人自己的抗骨髓瘤新药，惠及临床患者。

专家简介

郝 牧

中国医学科学院血液病医院（血液学研究所）

实验血液学国家重点实验室研究员，PI， 博士生导师

中国免疫学会血液免疫分会第五届委员会委员

中国抗癌协会血液肿瘤专委会浆细胞疾病学组副组长

中国病理生理学会实验血液学专青委会委员（第8第9届连任）

中国多发性骨髓瘤研究联盟委员及秘书

国家自然科学基金评审专家

Frontiers in Oncology，《中华血液学杂志》、《BLOOD中文版》审稿专家及通讯编委

在Journal of Clinical Investigation，Leukemia，Clinical Cancer Research及国内核心期刊上发表专业论文50余篇。获国家自然科学基金、中国医学科学院科技创新工程、中国医学科学院青年医学人才奖励项目、天津市自然科学基金等国家级及省部级科研项目资助。

获国家发明专利及教育部科技进步奖等。

研究方向：

浆细胞肿瘤分子发病机制及耐药逆转策略