编者按：美国血液学会（ASH）是最负盛名的血液病学国际盛会之一。第64届ASH年会已于2022年12月10-13日在美国路易斯安那州新奥尔良隆重召开。本次会议上，多项关于多发性骨髓瘤的基础与临床研究的最新成果得以向全球学者展示。《肿瘤瞭望》有幸邀请了美国Dana-Farber癌症研究中心的刘继业博士与我们分享其中一项有关多发性骨髓瘤的重磅研究：全基因组CRISPR-Cas9技术筛选出KDM6A基因参与调控了达雷妥尤单抗在多发性骨髓瘤患者中的敏感性。我们进行了文字整理，以飨读者。

 

 

全基因组CRISPR-Cas9筛选出KDM6A能够调节多发性骨髓瘤患者对达雷妥尤单抗的敏感性

 

Daratumumab（达雷妥尤单抗，简称Dara）是第一款开发上市的抗CD38单克隆抗体，Dara在骨髓微环境中可触发针对多发性骨髓瘤（MM）细胞的直接杀伤作用和免疫介导的细胞毒作用。重要的是，包含Dara的联合疗法在复发/难治和新诊断的MM患者中都获得很高的缓解率和缓解深度。然而，随着Dara耐药性的出现，患者仍然会面临疾病复发。

 

作为一种免疫靶向药物，Dara的抗肿瘤活性与MM细胞CD38的表达水平密切相关，无应答者的CD38表达水平较低。为了鉴定MM细胞中介导CD38表达和Dara敏感性的新型调节因子，我们在体外进行了全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选。我们鉴定了46种不同的sgRNA，它们与Dara和原代NK细胞触发的针对MM细胞的细胞毒作用呈正相关。使用全基因组sgRNA文库感染细胞后，流式分选出CD38表达最低的5%的骨髓瘤细胞，我们进行了第二轮筛选，发现KDM6A是两次筛选出的重叠基因集中重要的表观调控基因。我们的研究证实，敲除骨髓瘤细胞KDM6A基因能够显著降低CD38的表达水平（>2倍，P<0.01）；将KDM6A再次重新引入KDM6A基因被敲除的MM细胞，则CD38的表达水平和Dara诱导的细胞毒作用有所恢复。

 

KDM6A基因编码赖氨酸特异的去甲基化酶6A，其通过去甲基化组蛋白H3的赖氨酸27（H3K27）以促进基因表达。为了确认H3K27的甲基化状态能够改变CD38表达，我们采用ChIP-seq和ChIP-qPCR技术比较了KDM6A基因敲除细胞和对照组细胞的CD38启动子区域，发现KDM6A敲除细胞中的H3K27me3甲基化水平更高，从而抑制了CD38的转录。我们将CD38重新引入KDM6A敲除细胞中，发现CD38过表达仅能够部分恢复KDM6A敲除细胞对Dara的敏感性。这表明除了CD38下调之外，还有其他机制参与KDM6A基因敲除诱导的Dara耐药性。因此我们在KDM6A敲除细胞中进行了RNA-seq分析，同时结合前面CRISPR筛选出的候选基因，发现CD48（一种NK激活配体）表达出现下调，从而抑制了NK细胞的活性。在KDM6A敲除细胞中过表达CD48能够显著增加NK细胞颗粒酶B和穿孔素的分泌水平，从而恢复NK细胞活性，并恢复KDM6A敲除细胞对Dara治疗的敏感性。这些数据表明，KDM6A不仅调节CD38表达，还通过CD48来调控NK细胞活性，从而介导Dara的疗效。

 

KDM6A和EZH2在细胞中通过共同调节H3K27me3的水平来调控基因表达，因此我们认为EZH2抑制剂能克服KDM6A缺失所带来的肿瘤耐药。结果显示EZH2抑制剂能够显著降低CD38启动子区域的H3K27me3甲基化水平，从而上调KDM6A敲除细胞中CD38 mRNA和蛋白质的表达水平。重要的是，在体外实验和异种移植小鼠模型中，EZH2抑制剂能够恢复KDM6A敲除细胞对Dara介导的NK细胞的细胞杀伤作用的敏感性。综上所述，我们的研究表明KDM6A能够调节MM细胞中CD38和CD48的表达。此外，我们验证了FDA批准的EZH2抑制剂Tazemetostat和Dara联合疗法能够克服临床前骨髓瘤模型中的Dara耐药性，为一些临床试验采用联合疗法克服Dara耐药性并改善骨髓瘤患者的预后提供了理论依据。

 

 

刘继业博士：目前，免疫治疗已经深刻改变了多发性骨髓瘤的临床治疗，我们实验室近年来主要关注达雷妥尤单抗的临床疗效。达雷妥尤单抗靶向骨髓瘤细胞表面的CD38分子，通过介导ADCC/ADCP等作用发挥杀伤骨髓瘤细胞的作用。在临床上，达雷妥尤单抗单药和联用疗法已经表现出非常好的效果。但是，几乎所有的多发性骨髓瘤在疾病后期都会出现耐药，因此我们课题组主要关注介导达雷妥尤单抗临床耐药的分子学机制，并采用CRISPR技术对全基因组进行筛选，发现了一些与达雷妥尤单抗耐药相关的基因。我们发现，KDM6A基因负责编码组蛋白3赖氨酸27（H3K27）去甲基化酶。敲除KDM6A基因可导致骨髓瘤细胞的CD38表达显著下降。ChIP-seq实验发现，敲除KDM6A基因后，CD38启动子区域的H3K27me3甲基化水平显著升高，从而抑制了CD38的表达。敲除KDM6A基因的骨髓瘤细胞表现出了对达雷妥尤单抗明显的耐药性。同时由于KDM6A基因属于肿瘤抑癌基因，敲除KDM6A能够明显增强骨髓瘤细胞的恶性程度。因此，敲除KDM6A基因通过升高CD38启动子区域的H3K27me3甲基化水平，从而抑制了CD38表达；而CD38表达水平降低，则进一步影响了临床上达雷妥尤单抗的疗效。

 

刘继业博士：除此之外，我们在KDM6A基因敲除的细胞中还发现CD48基因表达降低。CD48通常在肿瘤细胞表面表达，是激活NK细胞的配体。CD48通过与NK细胞表面的相应受体结合，从而激活NK细胞。我们发现敲除KDM6A基因后，肿瘤细胞CD48表达降低会影响NK细胞的功能，进而影响NK细胞所介导的达雷妥尤单抗对骨髓瘤细胞的杀伤作用。

 

刘继业博士：我们知道，KDM6A和EZH2共同调控H3K27me3甲基化水平、从而平衡细胞内基因的表达。在肿瘤细胞中，降低KDM6A表达会导致达雷妥尤单抗耐药。但是在临床上，我们很难做到提高KDM6A的表达水平，从而提高达雷妥尤单抗敏感性。然而，我们可以通过抑制EZH2的基因表达水平或者抑制EZH2的酶活性来降低H3K27me3甲基化水平，进而提高CD38以及CD48表达水平：一方面增强达雷妥尤单抗的靶标CD38的表达水平；另一方面通过调控CD48来增强NK细胞的功能，从而达到恢复或者增强骨髓瘤细胞对达雷妥尤单抗治疗的敏感性。

 

刘继业博士：达雷妥尤单抗主要通过识别骨髓瘤细胞表面CD38的表达水平，因此它的抗肿瘤作用主要是依赖于骨髓瘤细胞表面的CD38表达水平。已有文献报道，在一些临床前研究中，全反式维甲酸和组蛋白去乙酰化酶以及一些免疫调节剂可以显著提高CD38表达水平，从而增强达雷妥尤单抗的有效性。但是在后续的临床实验中，一些药物如全反式维甲酸却没有展现出与和达雷妥尤单抗良好的协同作用。

 

我们在实验中发现，EZH2抑制剂显示出与达雷妥尤单抗良好的协同作用。并且在临床上，EZH2抑制剂已经被批准用于滤泡淋巴瘤的治疗，展现出来良好的临床有效性。同时，一些临床实验发现EZH2也可以作为多发性骨髓瘤的潜在治疗靶点。我们认为，EZH2抑制剂在临床上与达雷妥尤单抗联合使用，不仅本身可以作为治疗靶点，同时还能够提高骨髓瘤细胞CD38的表达水平，从而增强骨髓瘤细胞对达雷妥尤单抗的敏感性。并且，EZH2抑制剂还能够提高CD48的表达水平，进一步提高骨髓瘤患者体内的NK细胞活性，来增强NK细胞对肿瘤细胞的天然免疫和NK细胞介导的达雷妥尤单抗对骨髓瘤细胞的杀伤作用。